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免疫沉淀是用于抗原檢測和純化的廣泛使用的方法之一
更新時間:2020-08-11 點擊次數:1403次
 
  
  免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應,從特定混合物(通常是細胞裂解液或表達上清)中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統的IP實驗是抗體與目的蛋白結合后,再與蛋白ProteinA/G(結合抗體Fc片段)偶聯的瓊脂糖或磁珠孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復合物,復合物經過洗滌、洗脫后用于后續下游實驗。IP是許多蛋白質相關研究的重要步驟,用于研究蛋白質的存在、相對豐度、蛋白表達的上下調、蛋白至穩定性及相互作用等。
  
  免疫沉淀的原理為:針對特定靶蛋白的抗體與樣品(細胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫復合物,隨后利用ProteinA-磁珠或ProteinG-磁珠將該免疫復合物從混合物中沉淀下來。后將靶蛋白從磁珠上洗脫(如果抗體沒有共價連接到磁珠上或使用變性緩沖液進行洗脫,抗體也會被洗脫下來),并通過SDS-PAGE,WesternBlot等手段對洗脫下來的蛋白進行分析。
  
  免疫沉淀固相物質的選擇:
  
  對于小型特定蛋白和蛋白復合物的分離,磁珠可實現結合能力、得率、可重復性、純度和成本節約之間的平衡。當進行手動和自動化標準IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反應并立即用于后續檢測分析時,磁珠是理想選擇。利用強力磁力架可將磁珠定位到孵育管的側壁,使其不阻礙細胞裂解物抽吸。磁性分離不需要離心,所以不會導致抗體-抗原結合破壞和目標蛋白損失現象。當需要純化大量目標蛋白用于下游分析,且特異性抗體較易獲得,瓊脂糖樹脂純化較為適用。
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