免疫熒光將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。
免疫熒光此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
免疫熒光步驟基本一致：
1.取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。
2.4％冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。
3.0.2％TritonX－100通透10分鐘，PBS洗三遍。
4.與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。
5.一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室溫2小時(shí)（避光），或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。
7.用DAPI染核，然后直接照熒光片。
8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。
建議：1.還是染完之后沒(méi)有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，再想照反而沒(méi)有了，另外不要拖太長(zhǎng)時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2.免疫熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過(guò)一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。
